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Fluo-3是一种常用的可见光激发波长Ca²⁺荧光探针，具有较高的Ca²⁺捕获能力，通过荧光强度的变化直接反映Ca²⁺信号的动力学变化。当Fluo-3以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的，但一旦与Ca²⁺结合即可产生很强的荧光，荧光信号增强60～80倍，此时的最大激发波长为506nm，最大发射波长为526nm。可通过激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等来检测胞内钙离子水平的变化。

Fluo-3,AM是Fluo-3的一种乙酰甲酯衍生物，具有细胞膜渗透性，只需简单培养，即可轻易进入细胞。一旦进入细胞内，即被其内酯酶剪切生成不具膜渗透性的Fluo-3，从而滞留在胞内以发挥相应生理功能。本品以冻干粉的形式提供，使用时只需经无水DMSO充分溶解，配置成2～5mM的储存液，并依据具体实验和相关文献资料调整到需要的工作浓度即可。

• 荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
  
• 乙酰氧基甲基酯（AM）易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。由于试剂微量，开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
  
• Fluo-3,AM在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可在20～25℃温育片刻至全部融解后使用。
  
• 基于BAPTA结构的钙离子指示剂比如Fluo-3，Fluo-4，能够结合很多重金属阳离子（比如：Mn²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺）且实质上亲和力高于Ca²⁺。因此，由于这些重金属离子存在对钙测定的干扰可使用重金属螯合剂TPEN(货号：KM0037)来控制。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• 试剂准备
  
  • 配制Pluronic F-127母液
    取100mg Pluronic F-127粉末(货号：KM0188)中加入500μL DMSO，配制成20%(w/v) DMSO母液。溶解过程需要在40～50℃加热20～30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。
    
  • Hanks Balanced Salt Solution（HBSS），w/o Ca²⁺，Mg²⁺
    
  • HEPES Buffer Saline
    配方：10mM HEPES，1mM Na2HPO4，137mM NaCl，5mM KCl，1mM CaCl₂，0.5mM MgCl₂，5mM glucose，0.1% BSA，pH7.4
• 操作步骤
  
  • 用无水DMSO溶解Fluo-3,AM配制成2～5mM的储存液，或将已配好的Fluo-3,AM储存液取出于室温回温。
    
    • 如：若配制成4mM的母液，需向50μg Fluo-3,AM中加入11μL无水DMSO。
  • 向Fluo-3,AM+DMSO溶液中加入等体积的20% Pluronic F-127溶液，Pluronic F-127可以防止Fluo-3,AM在HBSS中聚合并促使探针更好进入细胞。
    
    • Pluronic F-127可降低Fluo-3,AM的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议将其加入储存液长期保存。
  • 用HBSS稀释Fluo-3,AM溶液，制备2～5μM的Fluo-3,AM工作液。
    
    • 推荐该探针加载浓度在4～5μM，具体的使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低浓度探针。
  • 将Fluo-3,AM工作液加入细胞，加入量以覆盖细胞为准。37℃孵育20min。
    
  • 加入5倍体积的含有1% FBS的HBSS，继续孵育40min。
    
  • 用HEPES Buffer Saline洗涤细胞3次，然后用HEPES Buffer Saline使细胞重悬，制成1×10⁵cells/ml的溶液。
    
  • 37℃孵育10min，之后用流式细胞仪或者共聚焦显微镜进行荧光钙离子检测。最大激发波长506nm，最大发射波长526nm。